沙門(mén)氏菌流行性的增加以及豬對(duì)抗生素耐藥性增加促使人們尋找抗生素的替代品。腸桿菌肽(MccJ25)是一種由大腸桿菌產(chǎn)生的抗菌肽，對(duì)包括腸道沙門(mén)氏菌在內(nèi)的幾種病原菌都有很強(qiáng)的抑制作用。
本研究旨在體外評(píng)價(jià)腸桿菌肽對(duì)豬結(jié)腸微生物區(qū)系組成和代謝活性的影響。以天然存在于人和動(dòng)物的胃腸道中的羅伊氏乳桿菌與抗生素利福平進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。使用Illumina MiSeq技術(shù)對(duì)16S rRNA進(jìn)行測(cè)序以評(píng)估微生物多樣性，并使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和多元分析來(lái)評(píng)估抗生素降解產(chǎn)物和監(jiān)測(cè)豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝組的變化。
結(jié)果表明，腸桿菌肽和羅伊氏乳桿菌處理只引起豬結(jié)腸微生物區(qū)系微生物多樣性和代謝組的細(xì)微變化，而利福平引起氨基酸水平的顯著改變。盡管這些發(fā)現(xiàn)需要在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，但考慮到腸桿菌肽對(duì)病原體的選擇性和強(qiáng)大的抑制活性，這項(xiàng)研究為考慮腸桿菌肽作為獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中抗生素的可能替代品提供了第一個(gè)概念證明。
腸桿菌肽對(duì)豬腸道菌群連續(xù)培養(yǎng)模型的影響
Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model
由于國(guó)際市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，生豬生產(chǎn)已成為增長(zhǎng)最快的產(chǎn)業(yè)之一。2019年，豬肉是全球第二大消費(fèi)肉類(lèi)，占肉類(lèi)總產(chǎn)量的32.6%。盡管如此，養(yǎng)豬業(yè)近年來(lái)遭受了重大損失，主要原因是細(xì)菌感染率不斷上升。沙門(mén)氏菌會(huì)引起急性疾病，導(dǎo)致死亡率增加和生產(chǎn)力下降。豬是腸道沙門(mén)氏菌的主要宿主，沙門(mén)氏菌感染與豬只的腹瀉密切相關(guān)。許多沙門(mén)氏菌血清型已被證明與豬的慢性潰瘍性結(jié)腸炎或壞死性小腸結(jié)腸炎有關(guān)。因此，在養(yǎng)豬場(chǎng)，特別是在工業(yè)化國(guó)家，控制沙門(mén)氏菌感染在很大程度上是通過(guò)使用抗生素實(shí)現(xiàn)的。
抗生素被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)和獸醫(yī)以及家畜生產(chǎn)中，以治療細(xì)菌性疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。它們?cè)陴B(yǎng)豬生產(chǎn)中用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑是常見(jiàn)的，并對(duì)提高牲畜生產(chǎn)力和降低生產(chǎn)成本做出了重大貢獻(xiàn)。然而，它們的過(guò)度使用導(dǎo)致了多種抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)。這引起了公眾的關(guān)注，并導(dǎo)致幾個(gè)國(guó)家禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑?，F(xiàn)在迫切需要有效替代常規(guī)抗生素，以維持豬群健康和生產(chǎn)力。到目前為止提出的最有希望的替代品是由細(xì)菌產(chǎn)生的天然抗菌肽。
抗菌肽是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其分子質(zhì)量通常小于10 kDa。與常用的廣譜抗生素不同，抗菌肽是從mRNA翻譯而來(lái)的，其活性譜很窄，在納摩爾濃度下抑制相同或密切相關(guān)物種的菌株?？咕目蓮V泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)食品、人類(lèi)和獸醫(yī)等領(lǐng)域。腸桿菌肽(MccJ25)是研究最多的抑制革蘭氏陰性菌的抗菌肽之一。它具有典型的套索結(jié)構(gòu)，這種高度緊湊的結(jié)構(gòu)使腸桿菌肽對(duì)變性條件、高溫、極端酸堿性和某些蛋白酶具有顯著的穩(wěn)定性。添加腸桿菌肽的日糧已被證明可以改善斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，減輕腹瀉和全身炎癥。伴隨著大腸桿菌減少，乳桿菌和雙歧桿菌種類(lèi)的增加，提高了短鏈脂肪酸(SCFA)的含量。
在本研究中，我們使用PolyFermS連續(xù)發(fā)酵模型模擬豬近端結(jié)腸，在體外評(píng)價(jià)腸桿菌肽對(duì)豬結(jié)腸微生物區(qū)系組成和代謝活性的影響。將腸桿菌肽與廣譜常規(guī)抗生素利福平、羅伊氏乳桿菌進(jìn)行了比較。此外，我們通過(guò)研究這三種抗菌化合物的降解產(chǎn)物，探究它們對(duì)豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝的影響。
采用PolyFermS體外連續(xù)發(fā)酵模型，采用改良的Macfarlane培養(yǎng)基模擬豬近端結(jié)腸。在35天的發(fā)酵過(guò)程中，含有固定化豬糞便微生物群的第一階段反應(yīng)器與兩個(gè)第二階段控制和測(cè)試反應(yīng)器并行運(yùn)行，測(cè)試腸桿菌肽對(duì)微生物群組成和代謝活性的影響。以天然存在于人和動(dòng)物的胃腸道中的羅伊氏乳桿菌與抗生素利福平進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。使用Illumina MiSeq技術(shù)對(duì)16S rRNA進(jìn)行測(cè)序以評(píng)估微生物多樣性，并使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和多元分析來(lái)評(píng)估細(xì)菌素/抗生素降解產(chǎn)物和監(jiān)測(cè)豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝組的變化。
圖1：連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)裝置。
(A)由一個(gè)接種反應(yīng)堆和兩個(gè)試驗(yàn)反應(yīng)堆組成的PolyFermS模型概述。IR：固定化豬糞細(xì)菌的接種反應(yīng)器(30%v/v)；TR1、TR2：試驗(yàn)生物反應(yīng)器；S：穩(wěn)定期；T：處理期；W：洗滌期。
(B)實(shí)驗(yàn)處理和樣本收集時(shí)間表。
根據(jù)PMA-qPCR分析，在加入沙門(mén)氏菌和抗菌藥物后的前12小時(shí)內(nèi)，試驗(yàn)反應(yīng)器中特定菌群數(shù)量在總體組成上保持相對(duì)穩(wěn)定。然而，利福平對(duì)總細(xì)胞和擬桿菌的數(shù)量有誘導(dǎo)作用，直到發(fā)酵結(jié)束，除了乳酸菌科外，這些細(xì)菌群重新生長(zhǎng)。在發(fā)酵12小時(shí)后，單獨(dú)用沙門(mén)氏菌處理也觀察到類(lèi)似的效果，特別是對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響。相比之下，羅伊氏乳桿菌和腸桿菌肽對(duì)細(xì)菌總數(shù)沒(méi)有顯著影響。
通過(guò)對(duì)16S rRNA基因的測(cè)序，評(píng)估了受試抗菌劑對(duì)微生物區(qū)系組成的影響。沙門(mén)氏菌處理和羅伊氏乳桿菌處理組沒(méi)有檢測(cè)到微生物組成的顯著變化，這表明這些處理對(duì)24小時(shí)發(fā)酵過(guò)程中測(cè)得的總體微生物區(qū)系組成沒(méi)有影響。另一方面，與沙門(mén)氏菌相比，腸桿菌肽和利福平有顯著差異(p＝0.001)。
利用香農(nóng)指數(shù)和asv聚類(lèi)，通過(guò)α多樣性研究了處理對(duì)豬腸道微生物區(qū)系的影響(圖2)。結(jié)果表明，在發(fā)酵結(jié)束前的8h，利福平處理后的α多樣性顯著降低，證實(shí)了利福平對(duì)微生物區(qū)系組成具有影響。在結(jié)腸發(fā)酵結(jié)束時(shí)，沙門(mén)氏菌組α多樣性下降，但并不顯著；腸桿菌肽和羅伊氏乳桿菌處理組在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有引起阿爾法多樣性的顯著變化。
圖2：用16S rRNA基因擴(kuò)增序列測(cè)序法測(cè)定沙門(mén)氏菌單獨(dú)接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)合用對(duì)豬腸微生物區(qū)系的影響。
通過(guò)門(mén)水平的分類(lèi)分析，進(jìn)一步評(píng)估了受試抗菌劑對(duì)豬腸道微生物區(qū)系組成的影響。結(jié)果表明，利福平處理導(dǎo)致了變形桿菌和菌門(mén)變形桿菌的相對(duì)豐度增加(圖3)。
圖3：沙門(mén)氏菌單獨(dú)接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)聯(lián)合接種后，豬微生物區(qū)系基于16S rRNA基因的微生物群落結(jié)構(gòu)。
此外，從8小時(shí)開(kāi)始，利福平對(duì)大腸桿菌(ASV002)的相對(duì)豐度顯著增加(12小時(shí)的相對(duì)豐度超過(guò)44%)(圖4)。
圖4：沙門(mén)氏菌單獨(dú)接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)聯(lián)合接種對(duì)豬腸微生物區(qū)系的影響。
這些數(shù)據(jù)表明，與其他測(cè)試的抗菌劑相比，利福平顯著影響微生物區(qū)系組成，會(huì)影響腸道微生物區(qū)系的代謝活動(dòng)。
用LC-MS分析發(fā)酵液顆粒提取物，以評(píng)價(jià)腸桿菌肽、羅伊氏乳桿菌和利福平對(duì)豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝的影響。如圖5所示，腸桿菌肽和利福平對(duì)代謝組學(xué)的影響最大，但腸桿菌肽的作用隨著時(shí)間的推移而降低，而利福平的作用則增加(圖5B)。處理24 h后，腸桿菌肽處理組的代謝組學(xué)特征與試驗(yàn)前接近。相比之下，利福平對(duì)豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝組有顯著影響，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
圖5：PolyFermS模型中豬結(jié)腸微生物區(qū)系的代謝組譜。
(A)通過(guò)LC-MS獲得的每個(gè)處理的基峰色譜圖。
(B)從LC-MS數(shù)據(jù)獲得的PCA計(jì)分圖(左：PC1與PC2，右：PC1與PC3)。
由于腸桿菌肽對(duì)病原菌的選擇性、強(qiáng)大的抑制活性、穩(wěn)定性以及它引起的微生物區(qū)系組成的細(xì)微變化，腸桿菌肽可能被認(rèn)為是養(yǎng)豬領(lǐng)域中可能的抗生素替代品。
參考文獻(xiàn)：Naimi S, Zirah S, Greppi A, Lacroix C, Rebuffat S, Fliss I. Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model. Front Microbiol.
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