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數(shù)據(jù)以mean±SD表示(n=3)，無(wú)共同字母的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；T-AOC：總抗氧化能力。

2、日糧中免疫抗體對(duì)腸道免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可見，草魚腸道中錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、促炎細(xì)胞因子（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素8（IL8）、白細(xì)胞介素10（IL10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的表達(dá)水平。MnSOD各組無(wú)顯著差異（圖1a）和IL8的表達(dá)水平（圖1c）在所有組之間無(wú)顯著差異（P>0.05），但M3的表達(dá)水平在所有組中最高。TNF-α的mRNA水平（圖1d）在M3中達(dá)到峰值（P<0.05）。與其它組相比，M3組IL-1β的表達(dá)水平（圖1b）顯著上調(diào)（P<0.05）。隨著添加量增加，IL10和TGF-β在草魚腸道中的表達(dá)均先降低，然后緩慢增加，在M3組中達(dá)到最低表達(dá)水平。IL10的表達(dá)水平（圖1e）和TGF-β（圖1f）在M3組中的表達(dá)水平與其它組相比顯著下調(diào)（P<0.05）。圖1（g–k）顯示嗜水氣單胞菌攻擊后，所有組的腸中IL-1β、IL8、TNF-α、IL10和TGF-α的mRNA水平。與對(duì)照組相比，添加抗菌肽組M0-Ah中IL-1β的表達(dá)水平顯著增加（P<0.05）。與M0-M2相比，M3、M4和M5IL8（圖1h）和TNF-α（圖1i）的表達(dá)有顯著下調(diào)趨勢(shì)（P<0.05）。IL10的mRNA水平?jīng)]有顯著差異（圖1j）在所有組之間（除M1-Ah外）（P>0.05）。草魚腸道中，TGF-β的表達(dá)水平（圖1k）在M3-Ah達(dá)到峰值，與其他組相比有顯著差異（P<0.05）。

圖1.飼喂AMP (a-e)和攻毒嗜水單胞菌(g-k)后草魚腸道免疫相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白歸一化。數(shù)據(jù)以mean±SD表示(n = 3)。

3、腸道微生物區(qū)系的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群

3.1 腸道菌群的多樣性和豐富性

各組Shannon、Simpson、Chao和Ace指數(shù)沒(méi)有顯著差異（圖2a-d），而在Shannon指數(shù)中，NC組和M5-Ah與M0-Ah相比，顯著增加（圖2e）；在Ace指數(shù)（圖2g）和Chao（圖2h）指數(shù)中，與NC組相比，M2-Ah、M3-Ah和M4-Ah顯著降低。β多樣性分析的結(jié)果可以反映物種組成在不同類群中的分布。因此，不同樣本中微生物群落的相似性或差異性可以使用主坐標(biāo)分析（PCoA）來(lái)識(shí)別，這是β多樣性分析之一（圖2ij）。結(jié)果（圖2i）顯示，在從M0中分離出來(lái)的所有添加抗菌肽組（M3除外）中都有一些相似的組成，圖2j顯示了M1至M5-Ah中比M0和NC組更多的重疊元素。

圖2.各組腸道菌群的多樣性和豐富性

圖3.通過(guò)單因素方差分析比較六組腸道菌群的相對(duì)豐度

(a):門水平;(b):各組植物菌的相對(duì)豐度;(c): M0和M1的相對(duì)豐度;(d) M0和M2的相對(duì)豐度;(c): M0和M3的相對(duì)豐度;(d): M0和M4的相對(duì)豐度;(e): M0和M5的相對(duì)豐度。

圖4.通過(guò)單因素方差分析比較嗜水單胞桿菌攻毒組腸道菌群的相對(duì)豐度

(a):門水平;(b): NC和M0-Ah的相對(duì)豐度;(c): NC和M1-Ah的相對(duì)豐度;(d) NC和M2-Ah的相對(duì)豐度;(e): NC和M3-Ah的相對(duì)豐度;(f): NC和M4-Ah的相對(duì)豐度;(g): NC和M5-Ah的相對(duì)豐度;(h): M0-Ah和M1-Ah的相對(duì)豐度;(i): M0-Ah和M2-Ah的相對(duì)豐度;(j) M0-Ah和M3-Ah的相對(duì)豐度;(k): M0-Ah和M4-Ah的相對(duì)豐度;(l): M0-Ah和M5-Ah的相對(duì)豐度。

3.4 腸道菌群組成與免疫相關(guān)基因的相關(guān)性研究

如圖5所示，螺旋體門和異常球菌-棲熱菌門的相對(duì)豐度與IL-1β、MnSOD和TNF-α的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（P<0.05），而藍(lán)藻門和硝化螺旋菌門分別與IL10和IL-1β的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)（P<0.05）。此外，變形菌門和異常球菌-棲熱菌門的相對(duì)豐度與IL8的mRNA表達(dá)水平之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。圖5b顯示，梭桿菌和衣原體的相對(duì)豐度與IL-1β的mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（P<0.05），但是，與酸桿菌和軟壁菌門呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），髕骨細(xì)菌門與IL8呈負(fù)相關(guān)。

圖5.免疫防御系統(tǒng)相關(guān)基因與培養(yǎng)組(a)和攻毒組(b)腸道微生物相對(duì)豐度在門水平上的相關(guān)性Pearson相關(guān)系數(shù)由不同顏色體現(xiàn)(青色黑色:正相關(guān);紫色:負(fù)相關(guān))。

本研究表明，在飼料中添加400~800 mg/kg的抗菌肽可以改善草魚腸道結(jié)構(gòu)，增加草魚腸道菌群的多樣性。此外，抗菌肽還能抑制某些致病菌，如嗜水氣單胞菌，增加厭氧菌數(shù)量，提高腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。但極高的劑量會(huì)抑制腸道消化、營(yíng)養(yǎng)吸收能力和微生物多樣性。抗菌肽已被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖以增強(qiáng)健康，但其與水生生物腸道菌群的相互作用還有待進(jìn)一步探索。