由于近年來抗生素濫用帶來了巨大的環(huán)境壓力，ARGs（抗生素耐藥基因）被歸類為新興的污染物。ARGs廣泛存在水、土壤、沉積物、氣溶膠、作物和微塑料等環(huán)境中。ARGs的富集和多重耐藥菌的出現可能會導致抗生素作用降低，從而增加疾病的治療成本和難度。因此，ARGs越來越受到專家和公眾的關注。
抗菌肽在殺滅和控制微生物以及調節(jié)免疫反應中扮演著重要的角色，因此被用作水產養(yǎng)殖中抗生素的備選方案。當前在水產養(yǎng)殖中抗菌肽的研究主要集中在它們功能上的報道，抗菌肽能夠使蝦具有更加高效的免疫反應，提高吞噬細胞對鱒魚養(yǎng)殖中活微生物的吞噬能力和細胞內殺傷能力，并且表現出廣譜的抵御各種微生物的活性。本研究通過魚的養(yǎng)殖試驗來探索使用枯草三十七肽干預抗生素耐藥的潛在功能。對ARGs在不同環(huán)境中的分布以及不同處理的微生物群落進行分析研究。為枯草三十七肽應用于水產養(yǎng)殖替代抗生素控制ARGs提供有價值的理論依據。
本試驗使用的水產抗生素包括磺胺嘧啶（SDZ，含量≥98%）、土霉素（OTC，1mg藥物效價≥930IU）和恩諾沙星（EFC，含量≥98%）。本試驗使用含量為99%的枯草三十七肽購自中農穎泰生物肽公司（中國北京）。本水產養(yǎng)殖試驗選用的魚為尼羅羅非魚，購自林春漁業(yè)公司（中國廣州），在自來水水箱中培育3個月并收集樣品進行下一步的分析。
試驗分為1個對照組和4個試驗組。對照組飼料中不含任何抗生素和抗菌肽，各試驗組分別添加枯草三十七肽（Cecropin peptide，CP）、SDZ、OTC、EFC（按200mg/kg的含量分別添加到飼料中）。3個月后收集試驗各組的水樣分別命名為WFF\WCP\WSDZ\WOTC\WEFC，從一個沒有羅非魚的對照水箱中收集水樣并標記為WCK基礎水樣；收集的殘留物樣品（主要由魚排泄物組成）分別命名為RFF\RCP\RSDZ\ROTC\REFC；肌肉樣品分別標記為FFF\FCP\FSDZ\FOTC\FEFC。
ARGs在羅非魚養(yǎng)殖系統不同環(huán)境中的分布
枯草三十七肽有助于減少耐藥菌的豐度；經過枯草三十七肽的處理ARGs在魚肌肉中遷移的風險相對較低；枯草三十七肽處理的樣品中低豐度的intI1可以有效降低ARGs和多重耐藥菌的傳播風險。
圖1 羅非魚養(yǎng)殖系統水、殘留物和魚肌肉樣品中目標ARGs的絕對豐度熱圖。白色空白表示未檢測到。
在魚的飼料中添加枯草三十七肽可以有效地減少ARGs在魚肌肉和殘留物（主要是糞便）中的積累。而且，在FCP/RCP中所有目標ARGs的總絕對豐度與FFF/RFF相比是比較低的，也證明了枯草三十七肽能有效地減少ARGs的積累。
圖2 不同樣品中不同類型目標ARGs的總絕對豐度（a）以及所有目標ARGs、16S rRNA和intI1的總絕對豐度（b）。
羅非魚養(yǎng)殖中不同環(huán)境的微生物群落特征
不同抗生素處理樣品的OTU數據顯著的高于枯草三十七肽處理組和對照組?？莶萑唠奶幚斫M和對照組之間重疊的OTU占枯草三十七肽處理的水/殘留物/魚肌肉樣品中總OTU的70%/55.4%/62.5%，說明對照組與枯草三十七肽處理組的微生物群落具有比較相似的結構。不同抗生素處理樣品的微生物群落結構也存在一定差異，說明不同的抗生素可能對微生物群群落具有不同的影響。
圖3 不同樣品主要門類組成（a）、不同處理微生物群落三元圖（b）、不同處理樣品Circos圖（c）、不同樣品基于微生物群落的PLS-DA圖 （d）。
不同處理下16 S rRNA、intI1、ARGs和菌群的共現網絡
對照組、枯草三十七肽處理組和抗生素處理組樣品的ARG-ARG、屬-屬、和ARG-屬的共現網絡數據之間存在著顯著性關聯，分別達到了352、250和746。枯草三十七肽的處理有效地降低了ARG-ARG、ARG-屬和屬-屬之間的相關性。
經過枯草三十七肽處理后樣品中的多重耐藥菌顯著減少到3個屬，多重耐藥菌的減少有利于降低ARGs帶來的潛在風險，說明添加枯草三十七肽可能具有控制水產養(yǎng)殖中的ARGs和多重耐藥菌產生的作用。
使用抗生素養(yǎng)殖羅非魚可能會增加ARGs（抗生素耐藥基因）和相應的多重耐藥菌的風險。
圖4 不同樣品中intI1、16 S rRNA、靶ARG和屬之間的共現網絡，對照（a）、枯草三十七肽處理（b）和抗生素處理（c）。紅線代表正相關，藍線代表負相關。
ARGs在水產養(yǎng)殖中可能的影響途徑
有直接證據表明不同環(huán)境中的ARGs（抗生素耐藥基因）受到抗生素的使用（antibiotic usage）、細菌（bacteria）、可移動遺傳元件（MGE）及水樣水質（water quality）的正向影響；
不同因素對水樣ARGs的影響強度順序為細菌>MGE>使用抗生素>水質；
不同因素對殘留物和肌肉樣品中ARGs的影響順序為細菌>MGE>使用抗生素；
使用抗生素對不同環(huán)境中ARGs的影響順序為水樣>殘留物>魚肌肉；
PLS-SEM（偏最小二乘結構方程模型）結果進一步證明，在羅非魚養(yǎng)殖過程中，使用枯草三十七肽代替抗生素可以減少ARGs的產生。
圖5 基于偏最小二乘結構方程模型的不同因素對水（a）、殘留物（b）和魚肌肉樣本（c）中目標ARGs增殖可能的影響。
使用抗生素會增加耐藥基因和多重耐藥菌數量，而使用枯草三十七肽處理后多重耐藥菌數量比使用抗生素處理減少了75%，枯草三十七肽在控制抗生素耐藥基因和多重耐藥菌危害方面具有優(yōu)異的效果。
備注：原文中的天蠶素，主要有效成分為枯草三十七肽。
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